Wie kann ich die Werte einer Spalte in MySQL eindeutig halten?

Sie möchten, dass die S.No der Primärschlüssel bleibt und PCID + USERNAME eindeutig ist, so nah an dem, was Hammerite gesagt hat:

ALTER TABLE MyTable
    ADD PRIMARY KEY (`S.No`),
    ADD UNIQUE KEY `PCID_USER_uk` (`PCID`, `USERNAME`);